Monitoraggio di micotossine in mais nel nord Italia dal 2011 al 2021: micotossine regolamentate, mascherate ed emergenti e metaboliti fungini

Il mais è tra le colture cerealicole e foraggere più importanti in Italia: utilizzato prevalentemente come alimentazione animale, oltre che per il consumo umano, risulta essenziale per tutti i prodotti a denominazione di origine protetta (DOP). Purtroppo è anche una delle colture più sensibili a funghi produttori di micotossine, principalmente a quelli appartenenti al genere Fusarium spp. e Aspergillus spp. Il nostro studio ha indagato sulla presenza delle micotossine regolamentate (fumonisine, aflatossine, deossinivalenolo e zearalenone) in campioni di granella di mais provenienti dalla Rete nazionale di monitoraggio, supportata dal Masaf, in un periodo di 11 anni (2011-2021). Inoltre è stata condotta un’indagine approfondita su un periodo di 4 anni, caratterizzato da condizioni meteorologiche estremamente diverse, per indagare la compresenza di micotossine regolamentate, mascherate ed emergenti.

Gli obiettivi di questa indagine erano duplici: il primo scopo era quello di redigere i profili di contaminazione da micotossine nel mais coltivato nel nord Italia al fine di evidenziare le condizioni ambientali che aggravano le contaminazioni da micotossine regolamentate. Il secondo obiettivo era studiare il ruolo delle micotossine emergenti e la loro compresenza con quelle regolamentate.

Micotossine regolamentate

La presenza di micotossine regolamentate è stata valutata in 3769 campioni di granella di mais raccolti dalla Rete nazionale di monitoraggio, per un periodo di 11 anni (2011-2021). Tale rete, coordinata dal CREA Centro di Ricerca Cerealicoltura e Colture Industriali, è composta da 88 centri di stoccaggio del mais distribuiti in cinque macroaree geografiche (Figura 1) della Pianura Padana, la principale zona di coltivazione del mais in Italia. I livelli di concentrazione delle micotossine sono stati determinati mediante test ELISA.

_{Figura 1. Distribuzione della Rete Nazionale di Monitoraggio del Mais in cinque macroaree geografiche: O, ovest (rosso); C, centro (verde); SP, sud padano (blu); A, adriatica (giallo) ed E, est (fucsia).}

Abbiamo analizzato le diverse tendenze meteorologiche nel periodo 2011-2021 considerando le precipitazioni medie giornaliere e la temperatura durante il periodo di maturazione del mais (Figura 2); i dati meteorologici sono stati prelevati da diverse stazioni meteorologiche ARPAE (Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale) situate nelle principali regioni italiane di coltivazione del mais. L’escursione delle precipitazioni osservata negli anni, dove è stata considerata la media di 10 stazioni meteorologiche, è stata compresa tra 152,08 mm nel 2011 e 350,33 mm nel 2014. Differenze significative sono state osservate anche per quanto riguarda le temperature.

_{Figura 2. Andamento meteorologico nel periodo 2011–2021.}

Le fumonisine B (FBs) sono state le micotossine più diffuse: l’analisi statistica ha mostrato che gli anni con la contaminazione più alta e più bassa sono stati il 2019 e il 2011. Durante questi anni, il livello di contaminazione variava tra 25 e 47.300 µg/kg. Nel corso degli anni in cui è stato condotto questo studio, la presenza di aflatossina B1 (AF B1) è stata inferiore a quella delle FBs, con un livello medio compreso tra 0,6 nel 2014 e 12,5 µg/kg nel 2012. Relativamente a deossinivalenolo (DON) e zearalenone (ZEA) nei lotti di mais, gli anni con i livelli di contaminazione più elevati sono stati il 2013 e il 2014 mentre il 2021 è risultato essere l’anno meno contaminato. Nel 2014 la concentrazione massima di DON ha raggiunto i 36.583 µg/kg e il 100% dei campioni analizzati è risultato positivo, cioè è stata riscontrata la presenza, seppur minima, della tossina.

La Figura 3 mostra la concentrazione media di ciascuna micotossina rilevata durante gli anni indagati. È stato riscontrato che le FBs (Figura 3A) sono endemicamente presenti in diverse aree geografiche, con livelli medi distribuiti compresi tra 1000 e > 4000 µg/kg. Per quanto riguarda la distribuzione di AF B1, i livelli medi sono generalmente distribuiti nelle classi 0–10 µg/kg. Nella figura sono evidenziate alcune piccole aree dove l’accumulo medio è stato maggiore (10–20 µg/kg). Le distribuzioni di DON e ZEA nel corso degli anni hanno mostrato generalmente una distribuzione media su tutte le classi di incidenza considerate.

Micotossine mascherate, emergenti e altri metaboliti fungini

Sono oltre 300 i metaboliti fungini secondari riferibili all’ambito delle micotossine, prodotti dai funghi che colonizzano i vegetali superiori. Le normative internazionali hanno in primo luogo posto l’attenzione verso i composti che più sembravano avere un forte impatto sulla salute dell’uomo e degli animali allevati. Tuttavia, se nel primo Regolamento Quadro sui contaminanti (Reg. 2006/1881/EU) per il settore food l’attenzione è stata posta nei confronti di 6 micotossine (Aflatossine B1, B2, G1, G2, M1; Deossinivalenolo (DON); Fumonisine B1, B2; Patulina; Ocratossina; Zearalenone), le conoscenze scientifiche e la possibilità di valutare analiticamente un maggior numero di tossine ha spinto la ricerca ad approfondire le indagini sulla presenza di molte altre micotossine. Alcune di queste sono state oggetto di nuovi Regolamenti (T2-HT2, Raccomandazione 2013/165/EU), mentre per una grande maggioranza, definite micotossine nuove o emergenti, si è atteso di avere a disposizione un quadro più ampio prima di inserirle eventualmente in Regolamenti. Lo stesso è stato seguito per le micotossine mascherate (es. deossinivalenolo-3-glucoside, DON-3-G), ovvero quelle micotossine prodotte in seguito a particolari modifiche (es. meccanismi di coniugazione) messe in atto dalla pianta sulla micotossina “nativa” principale (es. DON) in risposta all’attacco del patogeno, che conseguentemente sfuggono alle comuni metodiche analitiche di controllo.

Questa indagine, condotta nel quadriennio 2012-2015 ha permesso di valutare la presenza e il ruolo di queste micotossine nel panorama dei lotti commerciali di granella di mais raccolti nel Nord Italia.

Analisi LC-MS/MS multi-micotossina

I campioni dei lotti di mais provenienti dai centri di essiccazione e stoccaggio, raccolti durante il periodo 2012-2015, sono stati analizzati mediante un’analisi eseguita in cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa con metodo multi-micotossina. Il rilevamento e la quantificazione sono stati eseguiti con un sistema LC–MS/MS QTrap 5500 (Applied Biosystems, Foster City, CA), dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) TurboIonSpray e un sistema HPLC serie 1290 (Agilent, Waldbronn, Germania).

Micotossine mascherate

Nel periodo 2012-2015 è stato condotto un approfondimento per valutare i livelli di contaminazione delle micotossine mascherate, modificate e dei metaboliti fungini emergenti negli stessi lotti di mais. Per quanto riguarda le micotossine mascherate, le forme maggiormente rilevate sono state quelle associate al DON, come il deossinivalenolo-3-glucoside (DON-3-G), e le forme acetilate, 3-acetildeossinivalenolo (3-ADON) e 15-acetildeossinivalenolo (15-ADON) (Figura 4).

Nel complesso, le contaminazioni più elevate sono state rilevate per il DON-3-G, che in media ha raggiunto circa il 27% del livello di contaminazione da DON rilevato nel periodo 2012-2015, seguito dal 15-ADON, che ha mostrato il 12% del contenuto di DON, mentre il 3-ADON ha rappresentato solo il 2% della contaminazione da DON. L’anno 2014 è stato l’anno più contaminato da DON-3-G e da 15-ADON ed è stato significativamente diverso dagli altri anni. L’anno 2013, che è stato il secondo anno più contaminato, sia per il DON-3-G che per il 15-ADON, è stato anche il più contaminato per il 3-ADON.

Per quanto riguarda gli areali, l’areale Ovest è risultato significativamente più soggetto alla contaminazione di tutte le forme mascherate di DON rispetto agli altri areali, come precedentemente riportato per la forma di DON “nativa” (Figura 4).

Micotossine emergenti e altri metaboliti fungini

Le micotossine emergenti e i metaboliti fungini prodotti principalmente da Fusarium spp. della sezione Liseola, quali beauvericina (BEA), bikaverina (BIK), acido fusarico (FA), fusaproliferina (FUS) e moniliformina (MON), sono stati rilevati per tutti gli anni e in tutte gli areali. Gli effetti dell’anno e dell’area sulla presenza di queste micotossine emergenti e dei metaboliti fungini nei lotti di mais provenienti da centri di essiccazione e stoccaggio situati in diversi areali del Nord Italia durante il periodo 2012-2015 sono riportati nella Figura 5.

L’anno 2013 è stato quello con il più alto livello di contaminazione per tutti i metaboliti fungini rilevati, prodotti da Fusarium spp. della sezione Liseola, ad eccezione della MON, per la quale il 2012 è stato significativamente più contaminato rispetto agli altri anni. Per quanto riguarda gli areali, non sono state registrate differenze significative tra i diversi areali per nessuno dei metaboliti fungini riportati in Figura 5, ad eccezione di BIK e FA, per le quali l’areale Adriatico ha presentato una contaminazione significativamente maggiore rispetto agli altri areali.

Inoltre sono state rilevate per tutti gli anni e gli areali considerati anche le micotossine emergenti e i metaboliti fungini prodotti principalmente da Fusarium spp. della sezione Discolor, quali aurofusarina (AUR), butenolide (BUT), culmorin (CULM) e nivalenolo (NIV), come riportato in Figura 6. L’anno 2014 è stato quello con il più alto livello di contaminazione per tutti i metaboliti fungini rilevati prodotti da Fusarium spp. della sezione Discolor, ad eccezione della CULM, per la quale il 2013 è stato l’anno più contaminato. Come già descritto per le micotossine normate, DON e ZEA, prodotte da Fusarium spp. della sezione Discolor e per le forme mascherate associate al DON, anche per questi metaboliti fungini emergenti l’areale Ovest è stato uno degli areali più contaminato, tranne che per il NIV, per il quale non sono state registrate differenze significative tra gli areali (Figura 6).

Conclusioni

L’indagine condotta sui lotti commerciali di granella di mais ha confermato che Fusarium spp. è il fungo più frequente e le fumonisine sono le principali micotossine rilevate costantemente nelle diverse annate e zone. D’altro canto, a causa dei cambiamenti climatici, la granella di mais risulta soggetta a un aumento della frequenza di accumulo di aflatossine. DON e ZEA sono state riscontrate maggiormente in alcune aree del Nord Italia e in anni caratterizzati da condizioni meteorologiche predisponenti. Le contaminazioni da micotossine hanno mostrato una pronunciata variazione di anno in anno dovuta sia alle caratteristiche geografiche dell’area di coltivazione del mais sia alle condizioni meteorologiche durante i periodi sensibili dello sviluppo della granella, soprattutto durante il periodo di maturazione. Pertanto, la definizione delle aree/zone a rischio è essenziale per comprendere l’impatto delle contaminazioni da micotossine sulle catene alimentari e dei mangimi, in considerazione di uno scenario di cambiamento climatico in evoluzione.

Inoltre l’indagine ha confermato che a fianco delle micotossine principali (nel caso del Nord Italia: fumonisine, aflatossine, DON e zearalenone) sono presenti sia tossine mascherate, sia emergenti che altri metaboliti con azione simile. Tuttavia la loro presenza e il loro impatto non appare superiore a quello delle micotossine normate ed è stata inoltre evidenziata una forte correlazione tra le fumonisine e le tossine emergenti prodotte da Fusarium della sezione Liseola e tra il DON e le tossine emergenti e mascherate prodotte da Fusarium della sezione Discolor. Pertanto, i risultati ottenuti pongono in evidenza una simile ecologia delle micotossine emergenti e mascherate rispetto alle micotossine principali e quindi la possibilità di operare con successo il loro controllo quando si adottano le azioni nei riguardi delle micotossine principali.

Per tale motivo nelle Linee Guida per il Controllo delle Micotossine del mais e dei cereali vernini a cura del MASAF, gli strumenti e le strategie agronomiche volte a ridurre tali micotossine (normate, mascherate ed emergenti) sono esaminati assieme (https://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/ServeBLOB.php/L/IT/IDPagina/17783). Pertanto le soluzioni così inquadrate rendono l’introduzione di nuovi limiti regolamentari al momento meno pressante.

Bibliografia:

I risultati di questa indagine e la relativa bibliografia sono stati pubblicati sulla rivista Toxins: Locatelli, S.; Scarpino, V.; Lanzanova, C.; Romano, E.; Reyneri, A. Multi-Mycotoxin Long-Term Monitoring Survey on North-Italian Maize over an 11-Year Period (2011–2021): The Co-Occurrence of Regulated, Masked and Emerging Mycotoxins and Fungal Metabolites. Toxins 2022, 14, 520. https://doi.org/ 10.3390/toxins14080520

Ringraziamenti:

Un ringraziamento particolare ai centri di essiccazione – stoccaggio aderenti alla Rete di monitoraggio micotossine Mais.

La presente ricerca è stata realizzata con il contributo finanziario del Ministero dell’agricoltura, della sovranità alimentare e delle foreste, Masaf, nell’ambito dei seguenti programmi di ricerca: MICOPRINCEM, RQC MAIS (D.D. N. 88666, 03/12/2014) e RETI2020 (prot. 198541, 30/04/2021). Nel 2018, inoltre, il CREA ha svolto questo lavoro in collaborazione con ISMEA nell’ambito del progetto “Osservatorio Territoriale della Qualità del Cereale” del Piano Cerealicolo Nazionale, finanziato dal Masaf.