Una delle maggiori preoccupazioni degli operatori della filiera agrozootecnica riguarda i controlli sulle materie prime, indispensabili per verificare la contaminazione da aflatossine nelle partite di mais.
Questi controlli devono poter garantire che le concentrazioni di micotossine siano al di sotto dei limiti di tollerabilità consentiti. Devono inoltre garantire che l’esito delle analisi svolte sia rappresentativo non solo del singolo campione esaminato, ma dell’intero lotto di riferimento.
Molto spesso le determinazioni analitiche richiedono tempi incompatibili con l’attività di strutture come i mangimifici o i consorzi, che hanno bisogno di informazioni tempestive sulle partite di cereali in entrata in Azienda.
Criticità legate alla determinazione di aflatossine nel mais
Esaminando la situazione in generale, quindi, si possono individuare tre principali punti di criticità inerenti le determinazioni di aflatossine nel mais:
Errori di campionamento: nonostante esistano rigorosi protocolli, il campionamento resta una delle principali cause d’errore nella determinazione delle micotossine nel mais.
Scarsa rappresentatività dei campioni: le analisi effettuate sui campioni di mais vengono svolte prelevando pochi milligrammi di mais omogenato. Una quantità così esigua di matrice non può essere rappresentativa di un lotto da diverse tonnellate, anche presupponendo un’efficace procedura di campionamento.
Incompatibilità dei metodi ufficiali di analisi con le realtà operative nel settore agrozootecnico: i tempi, i costi ed il personale specializzato, necessario allo svolgimento di analisi come ELISA o HPLC, rendono l’applicazione di queste metodiche poco pratica ai fini di un controllo rapido, efficace e rappresentativo.
Il metodo “Aflaflesh” riduce le criticità legate alla determinazione delle aflatossine nel mais
Dalla iniziale collaborazione di Star Ecotronics s.r.l. con l’Università degli Studi di Milano e con il Consorzio Agrario di Milano e Lodi, è stato ideato un nuovo sistema di monitoraggio automatico per la determinazione indiretta delle aflatossine nel mais: “Aflaflesh”.
Questo sistema è basato sulla rilevazione della fluorescenza emessa dall’acido kojico su cariossidi di mais contaminate ed è stato messo a punto e successivamente brevettato.
Punto di partenza di questo sistema è una caratteristica intrinseca dell’acido kojico: quando viene eccitato da radiazioni UV, ri-emette luce nelle bande del rosso e del verde ed è facilmente rilevabile. La tecnologia “Aflaflesh” sfrutta questa proprietà servendosi di radiazioni UV-A (315-400 nm) emesse da una lampada di Wood, e di una telecamera ad alta definizione in grado di rilevare, registrare e quantificare le emissioni luminose.
Teoria alla base del sistema “Aflaflesh”
Come descritto in precedenza, il sistema “Aflaflesh” non rileva direttamente la fluorescenza emessa dalle alfatossine, ma quella emessa da un altro metabolita fungino: l’acido kojico.
Studiando la produzione metabolica di uno dei più importanti microorganismi produttori di aflatossine, Aspergillus flavus, è stato possibile verificare la produzione contemporanea di aflatossine ed acido kojico nella maggior parte dei campioni esaminati. L’acido kojico, tuttavia, è presente in concentrazioni molto più elevate rispetto alle aflatossine, ed è perciò facilmente individuabile. Le aflatossine, invece, sono presenti in concentrazioni troppo basse perché la fluorescenza emessa sia determinabile senza una strumentazione sofisticata e costosa.
Lo studio che permette di correlare la presenza di aflatossine con quella di acido kojico è attualmente in fase di perfezionamento: con i nuovi dati relativi alla produzione metabolica di Aspergillus flavus sarà possibile giustificare con solide basi genetiche e biochimiche le determinazioni analitiche fino ad ora effettuate, che correlano la presenza di concentrazioni rilevanti di acido kojico con il processo di aflatossinogenesi.
Come funziona il sistema “Aflaflesh”
La procedura per svolgere uno screening preliminare con “Aflaflesh” è semplice e veloce.
La granella di mais viene macinata grossolanamente, e può essere osservata in quantitativi che vanno da 1 a 5 kg per volta.
Una volta introdotta nella macchina, la granella viene trasportata e opportunamente distribuita sul nastro, passa sotto la lampada ad UV e la telecamera ad alta risoluzione. Grazie al software Cornvision® (Star Ecotronics), viene rilevata e registrata la fluorescenza delle cariossidi: il valore di questa fluorescenza, espresso in pixel, viene convertito in ppb grazie ad una curva di calibrazione impostata. Questa curva è stata costruita esaminando con “Aflaflesh” sei milioni di cariossidi di mais ed effettuando sulle stesse 150 analisi in HPLC presso laboratori accreditati.
Attualmente, nel processo di miglioramento e perfezionamento del sistema “Aflaflesh”, questa curva è stata potenziata per rappresentare più efficacemente anche concentrazioni più alte di aflatossine e per aumentare la numerosità dei punti.
Determinazione delle aflatossine con il metodo “Aflaflesh”
Il sistema “Aflaflesh” si basa sull’analisi visiva delle aree fluorescenti presenti sul mais contaminato. Le cariossidi vengono preventivamente spezzate per poter individuare anche le contaminazioni interne e avere una lettura più rappresentativa del campione. Le aree fluorescenti vengono individuate dal sistema seguendo principalmente due parametri:
La fluorescenza nel verde e nel rosso viene conteggiata, la fluorescenza in altri intervalli viene invece scartata.
Le aree fluorescenti minime, dovute a polvere o frammenti, non vengono conteggiate.
Nel rispetto dei parametri impostati, il software conteggia i pixel relativi a ciascuna area fluorescente valutata e li somma, ottenendo un valore di pixel totali per ogni lettura.
Impiegando una curva di calibrazione la cui funzione è presente nel software, si può ottenere un valore in ppb della concentrazione di aflatossine, partendo dal numero di pixel fluorescenti rilevati nel campione.
Il rapporto di prova prodotto al termine di ogni lettura contiene una completa documentazione del test effettuato, e, in base alla concentrazione di AFB1 stimata, assegna il lotto di riferimento ad una precisa categoria di utilizzo oppure ne determina l’inaccettabilità.
Terminata l’analisi, poiché questo tipo di screening non è distruttivo, i campioni possono essere sottoposti a successive verifiche. Un altro vantaggio è che, impiegando solo una media di dieci minuti a lettura, è possibile in breve tempo effettuare diverse letture consecutive dello stesso campione, verificando così i valori ottenuti nella prima lettura, se fosse necessario.
Punti di forza del sistema “Aflaflesh”
Le sperimentazioni condotte sul sistema “Aflaflesh” hanno messo in evidenza i punti di forza di questo innovativo metodo di screening, che permette di ridurre le criticità indicate precedentemente, relative alla determinazione delle micotossine nel mais.
Impiegando campioni che vanno da 1 a 5 kg, viene notevolmente incrementata la rappresentatività del campione stesso rispetto al lotto di riferimento.
Sono necessari solo una decina di minuti per ciascuna lettura: è quindi possibile effettuare un numero molto più elevato di letture sui campioni di ciascun lotto, in tempi compatibili con le esigenze di consorzi e mangimifici.
La procedura di determinazione è semplice: non richiede né personale specializzato né laboratori in cui svolgere l’analisi, adattando l’intero processo alle realtà ed alle tempistiche ottimali per il settore agrozootecnico.
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Assalzoo – Redazione
